Бактериоскопическое исследование окрашенного мазка ( по Граму)

Где проводится: Во всех медицинских центрах и лабораториях «Тонус»

Понятие о бактериях

Диплококки представляют собой болезнетворные бактерии, которые могут быть обнаружены в организме мужчин и женщин. Самая распространенная причина появления – половой  контакт с инфицированным партнером.

Первичное заражение происходит в основном при несоблюдении гигиенических норм интимной гигиены.

Бактерии обладают сферическими и бобовыми формами, могут сливаться в пары и, в редких случаях образуют цепочки. Диплококки разделяются на грамположительные и грамотрицательные типы. Они, в свою очередь делятся на несколько видов и проявляются у человека преимущественно в среднем и подростковом возрасте.

Понятие о бактериях

Диплококки

В группе риска находятся люди с пониженным иммунитетом и представители обоих полов, которые часто сменяют половых партнеров. У детей заболевание встречается  редко, поэтому специалисты их в зону риска не относят. Однако профилактический осмотр у специалистов ребенку тоже рекомендован.

Техника проведения окраски

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Подготовка материала для окраски

Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. Гистологические срезы готовят по рутинной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.

Фиксация

При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации

Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с.

Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70—80 °С).

Химический способ фиксации

Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % — 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10—15 минут и затем высушивают на воздухе.

Процесс окрашивания мазков

  1. На фиксированный мазок наливают один из осно́вных красителей на 2—3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.
  2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1—2 мин раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1—2 минуты до почернения препарата.
  3. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока и мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20—40—60 секунд).
  4. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1—2 мин.
  5. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2—5 мин).
  6. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Микробиология. Окраска по Граму: красители, проведение, результаты

В микробиологии окраска по Граму имеет большое значение. Ее применяют для диагностики инфекционных заболеваний, выявления патогенности бактерий. Метод позволяет определить сходные по форме и размеру бактерии, которые относятся к различным видам и родам.

Особенности окраски

Окраска бактерий по Граму – сложный метод, в котором применяют два вида окраса: основной и дополнительный. В процессе выполнения манипуляции применяют обесцвечивающие вещества, к которым относятся спирты и кислоты.

Читайте также:  Как лечить уплотнение после прививки у ребенка?

Какая у вас степень владения языком?

В микробиологии окраску по Граму проводят трифенилметановой группой красителей. К ней относятся генциановые, метиловый синий, кристаллвиолет. Разные виды бактерий дают разные окрасы, образуя прочные соединения с красителями.

Окрасы

В микробиологии окраска по Граму бывает двух видов: грамположительная и грамотрицательная. В первом случае микроорганизмы дают прочные соединения с красителями и йодом. Во время анализа они не обесцвечиваются при воздействии со спиртом, из-за чего не изменяют своего первоначального фиолетового оттенка.

Грамотрицательные окрасы образуются при воздействии с йодом и легко разрушаются под действием йода. В результате микробы обесцвечиваются, а затем приобретают красный оттенок.

Подготовка материала

По правилам микробиологии, окраска по Граму требует предварительной подготовки материалов. Его необходимо распределить тонким слоем по поверхности стекла. Затем мазок подсушивают и после полного высыхания фиксируют. При этом мазок закрепляется на стекле, что позволяет исключить смывание бактерий красителями. К тому же мертвые микроорганизмы окрашиваются лучше, чем живые.

После подготовки материала подбирают метод окрашивания: физический или химический. Первый предполагает воздействие высокой температуры на микробную клетку. Во время химического способа применяют различные химические вещества, которые вызывают коагуляцию протеинов цитоплазмы.

Подготавливают набор для окраски по Граму, предметные стекла с бактериями. Их берут пинцетом или аккуратно пальцами за ребра мазком вверх, затем проводят пару раз над верхом пламени горелки. Процесс должен занимать пару секунд.

Процесс фиксации химическим методом предполагает использование ацетона, спирта, специальных смесей, жидкость Карнуа. Предметное стекло с высушенным мазком погружают в фиксирующее вещество на пятнадцать минут, затем просушивают на воздухе.

Окрашивание

Окраска мазков по Граму проводится по определенному алгоритму.

  • Сначала на фиксированный мазок наносят основной краситель на пару минут. Во избежание появления осадка процедуру выполняют с использованием фильтровальной бумаги.
  • Микробиология. Окраска по Граму: красители, проведение, результаты
  • Краситель удаляется (сливается), убирается бумага. Мазок погружается в раствор Люголя на две минуты или в йодистый раствор по Граму до почернения препарата.
  • Мазок поласкают спиртовым раствором или ацетоном, наливая и сливая его до тех пор, пока и мазок не обесцветится, и жидкость не станет чистой. Это занимает примерно от 30 до 60 секунд.
  • Стекла тщательно промывают дистиллированной водой.
  • Чтобы определить, есть ли в мазке грамотрицательные бактерии, проводят дополнительно окрашивание фуксином или сафранином. Препараты наносят на две минуты. В конце процедуры стекло промывают, высушивают.

    Результаты

    Все грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в красный. Шарообразные формы обычно относятся к грамположительным видам, а извитые формы – отрицательно окрашиваются. Палочковидные бактерии могут быть грамотрицательными и грамположительными.

    Чтобы получить максимально достоверные результаты исследований, рекомендуется применять суточные культуры, а также свежеприготовленные растворы для окрашивания.

    Механизм окраски позволяет увидеть и оценить физико-химические особенности строения цитоплазмы, клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

    У первых содержится много рибонуклеиновой кислоты, белков в цитоплазме, а в клеточных стенках – пептидогликана.

    Из-за этого во время обработки мазков генцианвиолетом и Люголем у грамположительных видов бактерий образуется прочное соединение ионов йода и красителя.

    При обработке спиртами грамположительные микроорганизмы удерживают краситель, а грамотрицательные – обесцвечиваются и окрашиваются дополнительно разведенным фуксином в красный оттенок. Некоторые бактерии способны окрашиваться только на стадии роста.

    Применение

    Окраску по Граму проводят при анализе вида микроорганизмов в мазках из влагалища и слюны. Этот способ позволяет определить вид микроорганизмов в кале, в плевральной, перитонеальной жидкости и не только.

    Любые жидкости, где могут содержаться бактерии, исследуют данным методом.

    После проведения окрашивания врачи подбирают метод лечения, назначая препараты, способные воздействовать на грамположительные или грамотрицательные бактерии.

    Источник

    Микобактерии туберкулеза

    Микобактерии* туберкулеза

    Возбудителями туберкулеза у человека являются М. tuberculosis (более 90% всех случаев туберкулезной инфекции, М. bovis (5%) и М. africanum (около 3%, главным образом среди населения стран тропической Африки). М. tuberculosis открыт Р. Кохом в 1882 г.

    Морфология и физиология. Микобактерии туберкулеза – грамположительные прямые или слегка изогнутые палочки. В состав микобактерии входят липиды (10-40%), миколовая, фтионовая, туберкулостеариновая и другие жирные кислоты.

    Структурный скелет клеточной стенки микобактерии представляет собой два ковалентно связанных полимера – миколат арабиногалактазана и пептидогликан, к которому присоединены белки, полисахариды, липиды.

    Такой сложный химический комплекс с высоким содержанием липидов придает клеткам микобактерии туберкулеза ряд характерных свойств: устойчивость к кислотам, щелочам и спирту, а также гидрофобность. Для окраски туберкулезных палочек применяют метод Циля-Нильсена.

    В культурах встречаются зернистые формы, ветвящиеся, зерна Муха – шаровидные кислотоподатливые, легко окрашивающиеся по Граму. Возможен переход в фильтрующиеся и L-формы. Неподвижны, спор и капсул не образуют.

    Для культивирования туберкулезных микобактерии в лабораторных условиях используют специальные питательные среды, содержащие яйца, глицерин, картофель, аспарагин, витамины, соли. Чаще всего применяют яичную среду Левенштейна-Йенсена и синтетическую среду Сотона. Размножаются микобактерии туберкулеза медленно.

    Читайте также:  Как выглядит сифилистическая сыпь и где она появляется?

    В оптимальных условиях время генерации составляет около 15 ч, тогда как бактерии многих других родов делятся через каждые 20-30 мин. Рост туберкулезных микобактерии можно обнаружить через 2-3 недели и позднее- до 2-3 мес, особенно в первых генерациях. На плотных средах образуются морщинистые, сухие колонии с неровными краями; в жидких средах на поверхности образуется нежная пленка, которая утолщается и падает на дно, среда при этом остается прозрачной. Для получения более гомогенного роста микобактерии к питательным средам добавляют твин – 80 (поверхностно-активное вещество).

    Антигены микобактерии содержат протеины, полисахариды, липиды, фосфатиды. Антитела к ним определяются в РСК, РНГА, преципитации в геле. Имеются общие и специфические антигены у М. tuberculosis, M. bovis и других микобактерии, включая сапрофитические виды.

    Патогенность туберкулезных микобактерии связана с прямым или иммунологически опосредованным повреждающим действием липидов (воском Д, мураминдипептидом, фтионовыми кислотами), а также туберкулином.

    Микобактерии туберкулеза

    Их действие выражается в развитии специфических гранулем и поражении тканей. Для вирулентных штаммов характерно наличие так называемого кордфактора – гликолипида, состоящего из трегалозы и димиколата.

    Он разрушает митохондрии клеток инфицированного организма, тем самым нарушая функцию дыхания. Микобактерии не образуют экзотоксин.

    Патогенез. В зоне проникновения и размножения микобактерии возникает специфический воспалительный очаг – инфекционная гранулема (первичный эффект). Затем развивается специфический воспалительный процесс в региональных лимфатических узлах и наблюдается сенсибилизация организма. Таким образом, формируется так называемый первичный туберкулезный комплекс.

    В подавляющем большинстве случаев первичный очаг имеет доброкачественное течение. Он рассасывается, пораженный участок кальцинируется и рубцуется. Однако этот процесс не завершается полным освобождением организма от возбудителя. В первичном очаге и лимфатических узлах туберкулезные бактерии могут сохраняться многие годы, иногда в течение всей жизни.

    Такие люди, оставаясь инфицированными, приобретают иммунитет к туберкулезу. При неблагоприятных заболеваниях, особенно на фоне плохих социальных факторов (недостаточное и неполноценное питание, неудовлетворительные жилищные условия, сопутствующие заболевания) может наступить активация возбудителя и генерализация процесса. Наиболее часто встречается туберкулез легких.

    Генерализация инфекции приводит к развитию внелегочных форм туберкулеза: кожи, костей и суставов, почек и других органов. Локализация процесса в определенной степени зависит от путей проникновения микобактерии в организм человека и вида возбудителя. Патогенетически важным является действие на организм инфицированного человека туберкулина. Впервые это вещество получил Р.

    Кох в 1890 г., а изученный им препарат был назван «старый туберкулин». Очищенный от примесей туберкулин (PPD – очищенный протеиновый дериват) является белком. Внутрикожное введение туберкулина вызывает у инфицированных микобактериями людей местную воспалительную реакцию в виде инфильтрата и покраснения (реакция Манту).

    Неинфицированные люди никакой реакции на введение туберкулина не дают. Эту пробу применяют для выявления инфицированных, сенсибилизированных людей.

    М. tuberculosis

    Грамположительный мир

    Эти микроорганизмы окрашиваются способом Грама в фиолетовый цвет. Смысл процедуры состоит в том, что толщина защитного слоя бактериальной клетки довольно высока, за счет чего краситель удерживается. Грамположительные бактерии представлены стафилококками, стрептококками. Кроме того, грамположительные бактерии – возбудители таких опасных недугов, как газовая гангрена, столбнячная инфекция, сибирская язва. От грамотрицательных бактерий они отличаются по строению и толщине клеточной стенки. Именно она определяет внешний вид микроорганизмов: спиралевидный холерный вибрион, шаровидная кокковая форма. Бактериальная клетка отличается от клеток млекопитающих наличием жесткого защитного каркаса, состоящего из плотного биополимерного слоя, и химическим составом. Этим обусловлена реакция бактерий на действие антибиотиков.

    Грамположительный мир

    Грамположительные бактерии имеют толстый ригидный слой (клеточную стенку). Защитная оболочка состоит из полипептидов и полисахаридов. До 70% стенки составляет муреиновый мешок. В его состав входят: лизин, ацетилглюкозаминин, ацетилмурамовая кислота, диаминопимелиновая и тейхоевые кислоты.

    Микроскопия нативного мазка, окраска по Граму

    Метод Грама представляет собой метод окрашивания микроорганизмов для исследования, что позволяет дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенке. Данное исследование было разработано в 1884 году датским врачом Гансом Кристианом Грамом.

    Для окрашивания мазка по Граму применяется анилиновый краситель — генциановый или метиловый фиолетовый и другие, после чего краситель фиксируют раствором йода.

    При промывании окрашенного препарата спиртом виды бактерий, которые оказались прочно окрашенными в синий цвет, называют грамположительными бактериями, они обозначаются Грам (+), — в отличие от грамотрицательных, Грам (−), которые при промывке обесцвечиваются.

    После промывания растворителем при окрашивании по Граму добавляется контрастный красный краситель, окрашивающий все грамотрицательные бактерии в красный либо розовый цвет.

    Данная особенность основана на наличии у бактерии внешней мембраны, которая не позволяет проникнуть красителю внутрь клетки.

    Анализ применяется для классификации бактерий, разделяя их на две группы, основываясь на строении их клеточной стенки.

    Окраска по Граму имеет важное значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

    Кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжи — грамположительны и при окрашивании приобретают иссиня-черный или темно-синий цвет, многие неспороносные бактерии — грамотрицательны и окрашиваются в красный цвет, при этом ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, а цитоплазма — розовый.

    Читайте также:  Ботокс или Диспорт, что лучше и какие есть альтернативы?

    Окраска по Граму – это достаточно сложный способ окраски, так как в этом случае на мазок воздействуют двумя красителями, один из которых является основным, а другой — дополнительным. Помимо красящих веществ при сложных способах окраски используются обесцвечивающие вещества, например, спирт или кислоты.

    При проведении окраски по Граму преимущественно применяются красители трифенилметановой группы, такие как генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллический фиолетовый.

    Грамположительные Грам (+) микроорганизмы формируют прочное соединение с перечисленными выше красителями и йодом.

    При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, в результате чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

    Грамотрицательные Грам (-) микроорганизмы формируют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под воздействием спирта соединение, вследствие этого происходит обесцвечивание микробов, благодаря чему они окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

    Показания

    Микроскопия нативного мазка, окраска по Граму

    Данное исследование назначается:

    при заболеваниях мочеполовых органов, например, цистите, уретрите, пиелонефрите, простатите для обнаружения их возбудителя;

    при заболеваниях ЛОР-органов, например, отите, синусите, рините, ангине, тонзиллите;

    при заболеваниях бронхолегочной системы, таких как трахеит, бронхит, плеврит, воспалительное поражение легких;

    при заболеваниях пищеварительного тракта инфекционного генеза, гастритах, энтеритах, а также острых кишечных инфекциях.

    Полученные результаты

    Метод Грама позволяет дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки.

    Окраска по Граму имеет важное значение в систематике бактерий, не менее важной она является для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

    Грамположительны кокковые (кроме представителей рода Neisseria) и спороносные (за исключением Coxiella burnetii) формы бактерий окрашиваются в иссиня-черный либо темно-синий цвет.

    Грамотрицательные многие неспороносные бактерии окрашиваются в красный или розовый цвет.

    Предполагаемые болезни

    Результаты микроскопии дают возможность ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различных видов микроорганизмов в биологическом материале, что также позволяет получить предварительную информацию об обнаружении этиологически значимого инфекционного агента в данном биоматериале, что позволяет специалисту быстро назначить корректное лечение (эмпирическое). Микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия), окрашенного по Граму, применяют при исследовании мокроты, гноя, отделяемого из ран, слизистых оболочек, например, мазка из цервикального канала, зева, носа, глаза, уретры, ротоглотки.

    Врач-консультант

    Данное исследование может быть назначено врачом общей практики, оториноларингологом, инфекционистом, хирургом, терапевтом, педиатром.

    Профилактика диплококка

    Профилактика является общей для всех видов заболеваний, которые вызываются диплококками.

    Исключением является менингококк.

    Он имеет специфические профилактические мероприятия.

    В качестве профилактики менингококка проводят вакцинацию.

    Такие меры профилактики имеют очень эффективное действие только при условии, что лечение после заражения будет проводиться своевременно.

    Отсутствие курса терапии имеет высокий процент смертности.

    Чтобы предупредить заражение через половые контакты, необходимо применять барьерные контрацептивы.

     Они позволяют снизить риск появления болезни.

    Если появились признаки патологического процесса, следует обязательно посетить врача и пройти лечение.

    При необходимости сдать мазок обращайтесь к автору этой статьи – венерологу в Москве с 15 летним опытом работы.

    Грамотрицательные бактерии

    Еще в 1884 году датский медик Грам изобрел особый метод изучения природы происхождения и некоторых особенностей микроорганизмов. Суть его заключается в окрашивании бактерий раствором особого состава.

    Основные виды грамотрицательных бактерий

    Одна из разновидностей бактерий, которая дифференцируется с помощью метода Грама, – грамотрицательные микроорганизмы. Особенность бактерий в том, что во время исследования они не окрашиваются в фиолетовый цвет. Как и любые другие бактерии, они могут подолгу жить в организме, при этом никак не проявляя себя. Но воспользоваться первой же удачной возможностью, чтобы начать размножение, грамотрицательные микроорганизмы не преминут.

    Важно понимать, что среди грамотрицательных бактерий есть и те разновидности, которые особого вреда организму не принесут, и те, которые способны приводить к летальному исходу.

    Подвидов вредоносных микроорганизмов существует очень много. К грамотрицательным бактериям относятся:

    • легионеллы;
    • бруцеллы;
    • спеирохеты;
    • псевдомонады;
    • франциселлы;
    • протеобактерии (среди которых и известная E Coli);
    • бордетеллы и многие другие.

    Эти микроорганизмы могут провоцировать проблемы с дыханием, работой сердечно-сосудистой системы и желудочно-кишечного тракта. В мазках пациентов могут находиться и грамотрицательные анаэробные бактерии – особо опасные микроорганизмы. Самые известные представители группы:

    Лечение грамотрицательных бактерий

    Даже с теми бактериями, которые опасности для жизни не представляют, бороться нужно. Как показала практика, эффективнее всего с грамотрицательными микроорганизмами борются сильнодействующие антибиотики. Так, например, бактерию E Coli и энтерококки можно уничтожить с помощью ампициллина или амоксициллина. В лечении грамотрицательных бактерий хорошо зарекомендовали себя и антибиотики-цефалоспорины (некоторые поколения в – большей степени, некоторые в – меньшей).

    Подобрать по-настоящему эффективное лечение можно только после того, как будет определен точный вид бактерии, поразившей организм. Причем чем раньше это будет сделано, тем лучше. Зачастую вредное соседство обнаруживается только на анализах. Поэтому-то специалисты и рекомендуют проходить регулярные комплексные обследования.